酶-加速细胞内化学反应的生物催化剂，在每个生物体中都扮演着至关重要的角色。这些酶的催化活性得到了广泛的认可，在温和的条件下以高特异性和高效率加速反应（图1）。
图1.酶的催化活性
近几十年来，生物催化剂的使用在多个工业过程中迅速扩大。这些酶根据它们催化的反应类型分为六大类：水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶和连接酶/合成酶。它们以细胞裂解物、整个细胞或纯化的酶的形式使用，要么从它们的原生细胞中制备，要么在备用宿主细胞中使用重组技术。与传统的化学催化剂相比，基于酶的催化可以提供显著的优势。生物催化不仅有助于加快制造过程，还可以提高质量，减少浪费，优化产品产量，确保更高的成本效益和更高的盈利能力。
在生物制药行业，酶正迅速成为开发新药、疫苗和诊断试剂盒的首选催化剂。它们的潜在优势包括对公认底物的特殊专一性、简化药物的合成路线，以及通过取代疫苗生产过程中通常使用的刺激性化学物质，为更可持续和对消费者友好的方法提供机会。尽管生物催化有明显的优势，但识别、获得、测试和优化具有适合特定应用的特性的酶的能力仍然具有挑战性。
筛选技术和生物信息学的进步推动了新酶变体的快速发现。在计算机建模的支持下，蛋白质工程的应用也扩大了改变酶结构以试图改善其性质的机会。每一种候选酶在一组特定的条件下都会发挥最好的作用，这些条件需要研发实验室仔细定义。但用于评估酶活性的传统检测方法有很大的局限性。随着生物/制药生产中对酶的使用需求的增加，需要准确和简化的酶活性和酶动力学分析。
酶分析的重要性
酶测定是测定酶活性的实验室方法，对于研究酶动力学和酶抑制是至关重要的。酶通过与其特定的底物结合并形成酶-底物复合体来工作。在特定的反应中，底物被转化为产物，然后被释放。酶活性衡量的是酶反应的速度，通常由特定时间内底物转化(或产物形成)的量来定义。
酶动力学描述了酶催化的化学反应进行的速度。反应的速度取决于酶的使用量和底物的量。虽然反应速度与酶的浓度成比例增加，但添加更多的底物最初会线性增加反应速度，但最终反应会达到最大速度。大多数酶分析传统上是基于光谱技术，最常用的类型是吸光度和荧光。由于其低成本和相对简单，分光光度分析仍然是最广泛使用的方法[1]。这种经典的酶测试包括通过测量溶液吸收或散射的光的强度的变化来跟踪反应的过程。基于光度法、计量法、96孔、384孔甚至1536孔微孔板格式的酶分析高通量替代了传统光谱技术。然而，由于边缘效应的影响，这些方法的孵化温度、温度稳定性和精密度有限，限制了它们的应用范围。
酶分析的挑战
测定酶活性是一项精密的工作，可能会受到许多变量的影响，如温度、pH、缓冲液类型或离子强度(图2)。确保所有这些变量都是固定的，对于在酶分析中获得可重复性的结果至关重要。例如，结果的准确性高度依赖于温度稳定性。温度只要变化1度，就会导致酶活性变化4-8%。以特定的顺序和时间间隔添加样品、缓冲液和底物对于获得准确可靠的结果也是至关重要的。
图2.可能影响酶活性测量的变量示例
传统光谱技术的主要缺点是涉及的所有步骤都是手工进行的，可能导致结果不一致。根据酶的类型，从样本开始到数据收集，每个酶的过程可能需要30到60分钟，这严重限制了吞吐量。这些方法只有在分析少数样品或执行常规任务时才适用。虽然微板格式方法为高通量分析提供了一种方便的替代方法，但该方法存在温度稳定、吸收校正和边缘效应等问题。由于吸光度是通过井在微孔板上垂直测量的，因此有几个因素会影响液体的路径长度，从而影响吸光度。因此，在光度学微孔板测量中，需要对光程长度进行修正以计算酶的活性，而与96孔板通常相关的“边缘效应”现象的主要原因被归因于与中心位置相比，圆周孔内蒸发速率的增加。
对于一些酶分析，有必要在特定的时间停止反应，以防止进一步产生产物。例如，可以在预定时间内每五分钟采集一次样品，然后使用高效液相色谱(HPLC)进行测量，每次分析需要30分钟才能完成。开发一种可靠的酶分析方法涉及许多步骤，通常需要做大量的工作(图3)。整个方法的开发既费力又耗时，即使是训练有素的人员也需要四到六周的时间。这一过程从确定关键方法变量开始，这需要对多组样本进行测试，以确定最佳实验条件。显然需要一种利用自动化解决方案的新方法，以克服与传统酶分析方法相关的关键挑战。
图3.酶分析方法开发的六个步骤。
利用离散分析技术简化酶分析
创新的专用离散分析仪的引入提供了精简和简化酶分析的机会。这些专用的离散分析仪(酶分析仪)可以有效地在一台仪器中同时分析许多不同的酶和测量条件，提供一致和可靠的性能。所有必要的酶分析步骤都是自动化的，这有助于控制变量，使整个方法开发变的容易和可重复。
与传统的酶分析方法相比，全自动酶分析仪具有几个优点。首先，这些仪器提供了完全自动化可靠的酶分析所涉及的关键步骤的机会。为了获得一致的结果，应在定义明确的条件下进行分析，这些条件可在其他实验室复制。精确的温度控制在±0.3℃以内，消除了样品过热的风险，并提供了准确的孵化时间。卓越的温度控制，加上没有边缘效应，可以确保结果的可信度。精确的液体处理(样品、缓冲液和底物添加混合)也可以在不影响产量的情况下提高实验之间的重复性[2]。
这项技术还可以提高生产率。在仪器内，样品同时准备和排队，提供一套又一套结果。这使得评估许多不同的酶、底物和方法变得更快更容易[2]。完全自动化的工作流程还可以实现更简单、更快速的整体方法开发。一旦建立了测试工作流程，仪器就可以无人看管，从而为实验室工作人员腾出时间执行其他重要任务。由于酶分析仪附带的专用软件，工作流程很简单，几乎没有从一种方法到另一种方法的转换时间。数据可追溯性由带时间戳的原始数据、审核跟踪。
每种酶类型灵活的方法参数-测量波长、空白测量、缓冲液添加、试剂添加、底物添加、特定酶孵化温度和时间以及数据收集持续时间-允许开发酶分析并将其从研发转移到质量控制实验室。最后，与分光光度法和微板法不同，专用的酶分析仪可以提供从25℃到60℃的广泛培养温度，扩大了潜在的应用范围[3]。
结论
对于许多生物/制药制造商来说，用酶来催化反应来取代化学品是有好处的。生物催化遵循绿色化学原则，为药物合成和疫苗开发等过程提供了一个成本低廉、可持续制造的有吸引力的选择。基于离散分析仪技术的酶分析仪为酶的研究和分析提供了显著的优势，包括便捷的效率与更快、更容易和可重复性的方法开发相结合，从而产生更好的结果。这些仪器可以帮助满足日益增长的自动化和数字化需求，同时克服与传统酶分析相关的挑战。准确、简化的酶活性和动力学分析的使用将为生物催化在开发新的药物、疫苗和诊断试剂盒中的广泛应用铺平道路。
参考文献
1. H. Bisswanger, Perspectives in Science 1 (1–6) 41–55 (2014).
2. S.F. Xu, et al., Journal of Food Safety and Quality 8 (11) 4208–4211 (2017).
3. M.E. Peterson, et al., Biochem J. 402 (2) 331–337 (2007).
