目前研究发现有多种蛋白水解酶可用于解离细胞，其中最常使用的是丝氨酸蛋白酶家族成员胰蛋白酶。在胰脏中胰蛋白酶的前体被胰蛋白酶原合成，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。在 pH为7-9之间 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。用高胰蛋白酶浓度长时间孵育，会剥离细胞表面蛋白并杀死细胞。
胰蛋白酶为许多细胞类型所耐受；然而，在蛋白质组学研究和无血清培养中需要避开胰蛋白酶。根据应用和细胞类型，可采用不同成分和浓度的胰蛋白酶，其部分性质如下。
EDTA（乙二胺四乙酸）：在存在钙的情况下，粘附分子决定细胞-细胞以及细胞-基质间的相互作用。为了减弱这种相互作用，经常会在胰蛋白酶中添加EDTA（产品号：E274376），其螯合二价阳离子（Ca2+，Mg2+）。
酚红：胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范围内实现。在此范围内的酚红呈粉红色。由于环境条件，胰蛋白酶的pH可能变为酸性，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。使用NaOH调节pH至7.4-7.6可以优化胰蛋白酶活性。
稀释剂：将浓缩的胰蛋白酶溶解或稀释在不含Ca2+或Mg2+的缓冲盐溶液中，例如Hank平衡盐溶液（产品号：E301773），以维持pH和渗透平衡。此外，一些胰蛋白酶产品含有0.9％ NaCl作为稀释剂，而不是Hank平衡盐溶液。
来源和形式：胰蛋白酶的主要来源是牛和猪，主要以冻干粉末和溶液形式提供。为了避免动物或微生物产品，重组牛胰蛋白酶也在玉米中表达，称为Trypzean溶液。
浓度：根据细胞类型和应用，需要对胰蛋白酶浓度进行调整。对于强附着细胞系，使用2.5％至0.25％（1×至10×倍稀释）的胰蛋白酶。尽管有需要细胞表面蛋白质完整性的研究，但一般采用较低浓度（0.05％胰蛋白酶）溶液。
实验方案
l将胰蛋白酶溶液、平衡盐溶液（不含Ca2+和Mg2+的溶液）以及生长培养基预热至37 °C。
l检查细胞，确保细胞是健康无污染状态。
l从培养瓶中取出并丢弃培养基。
l用不含Ca2+和Mg2+离子的平衡盐溶液轻轻冲洗细胞，然后除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗涤牢固贴壁的细胞。然而，对于敏感细胞，首选平衡盐溶液。
l将适量（0.5 mL/10cm2）预热后的胰蛋白酶溶液添加至培养瓶侧壁。轻轻旋转内容物以覆盖细胞层。
l将容器在室温下孵育2-3分钟。牢固贴壁的细胞可以在37 °C快速脱离。在显微镜下观察细胞。脱离的细胞在显微镜下呈现圆形且有折射光。如果脱离的细胞少于90％，则将培养瓶再孵育2分钟，并每隔30秒在显微镜下观察一次细胞。
注意：防止细胞暴露于胰蛋白酶溶液时间过长（≥10分钟）。
l细胞脱落后，加入2倍体积预热的完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。向细胞层表面轻轻移液培养基数次，以确保细胞回收率 > 95％。对于无血清培养物，以等摩尔浓度添加黄豆胰蛋白酶抑制剂（产品号：T113170）以抑制胰蛋白酶。
注意：剧烈移液会导致细胞损伤。
l将细胞悬液转移至试管中，并以300-1000×g离心5-10分钟。除去上清液，将细胞沉淀团轻轻重悬于预热的完全生长培养基中。用血细胞计数器和台盼蓝（产品号：T293438）排除法或自动细胞计数器，去除所需样品以确定活细胞的细胞密度。
l将剩余溶液稀释至接种密度，并将适量体积吸移至培养瓶中，然后将其置于培养箱中。
培养瓶面积 | 培养基体积 |
25 cm2 | 5 – 10 mL |
75 cm2 | 10 – 30 mL |
175 cm2 | 40 – 150 mL |
细胞解离常见问题及解决方案
细胞难以从培养瓶中脱离下来 | · 酶活性（胰蛋白酶）丧失或浓度低 | · 使用最佳浓度的新鲜酶 |
· 存在血清（抑制胰蛋白酶活性） | · 彻底冲洗以去除血清 | |
· 汇合度高，酶无法进入细胞-底物界面 | · 以较低的细胞密度使细胞脱落 | |
细胞粘附困难 | · 使用了高浓度的胰蛋白酶 | · 在短时间内用最适浓度进行胰蛋白酶消化 |
· 胰蛋白酶未完全失活 | · 添加血清以灭活胰蛋白酶 | |
· 污染 | · 使用抗生素来挽救培养物，如果14天后污染未被清除，则丢弃这批被感染的细胞。 | |
· 柠檬酸盐降低了钙的利用率，从而减少了细胞附着 | · 清除和降低细胞培养系统中使用的柠檬酸盐水平 | |
· 细胞膜损伤 | ·避免长时间暴露于胰蛋白酶，将培养基和培养物存放在远离荧光灯的地方，以减少自由基的毒性作用。 | |
细胞脱离且活力低下 | · 污染 | · 丢弃被污染的细胞 |
· 缺乏足够的附着因子和血清 | · 添加适当的附着因子和血清 | |
· 细胞高度汇合 | · 散开和疏导细胞 | |
· 氧化应激导致细胞变圆并从底物上脱离 | · 通过添加白蛋白、谷胱甘肽，最大限度地减少氧化应激 | |
· 胰蛋白酶溶液渗透度（pH）发生变化 | · 检查胰蛋白酶溶液的pH值 | |
细胞脱落后凝块 | · 使用了高浓度的胰蛋白酶 | · 以最佳浓度进行胰蛋白酶消化 |
· 剧烈吹吸 | · 温和吹吸 | |
· 剧烈、长时间离心 | · 温和离心（125×g 10分钟） | |
· 单层细胞年龄增加 | · 在细胞达到100％汇合之前散开和疏导细胞 | |
细胞膜损伤和细胞死亡 | · 脂质过氧化增加，降解了细胞膜导致细胞脱离 | · 添加抗坏血酸和谷胱甘肽以抑制脂质过氧化 |
· 无血清培养基中缺乏血浆铜蓝蛋白，会催化羟基自由基的形成并破坏细胞膜 | · 在配方中加入白蛋白和谷胱甘肽，以降低氧化损伤 | |
· 溶液中铁浓度增加，它支持细胞表面的自由基活性，破坏细胞膜 | · 通过转移，隔离铁传递到细胞 | |
· 过氧化氢在亚铁离子和亚铜离子存在下形成羟基自由基 | · 将甘露醇/丙酮酸盐加入培养基中，以络合并稳定过氧化氢。 | |
· 核黄素光分解形成过氧化氢 | · 在细胞培养物中加入新鲜的核黄素，避免细胞培养系统长时间暴露在光照下 | |
· 在氧化物、过氧化物、碳酸盐、羟基、磷酸盐和硫化物阴离子存在下，沉淀导致锌的丧失。 | · 添加锌与白蛋白/胰岛素的复合物以提高锌含量，并尽量减少氧化应激，以防止形成氧化物、过氧化物和硫化物。 |
