产品描述
用途：用于用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记游离聚糖。
描述：试剂盒包含通过还原胺化反应将染料偶联到聚糖的自由还原端的试剂。
染料性能：质量 = 137,荧光, ex (聚糖染料共轭物) = 250 nm, em = 425 nm.
为了获得最大的检测灵敏度，建议激发波长为250 nm。
样品数量：每组标记试剂12个单独的分析样品（每个试剂盒共24个样品）
样品量：每个样品25 pmol至25 nmol聚糖。
合适的样品：可以标记任何具有自由还原末端的纯化聚糖。
结构完整性：未检测到唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐的损失（<2摩尔%）。
标记选择性：基本上是化学计量标记
储存：室温、黑暗处储存。避免热源、光源和湿气。
装运：产品可在环境温度下装运。
处理：确保使用的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉手套，避免受到环境碳水化合物的污染。所有涉及标记试剂的步骤必须在干燥的环境中使用干燥的玻璃器皿和塑料器皿进行。一旦打开单个试剂瓶，应立即使用其内容物，多余的应根据当地安全规则丢弃。
安全性：仅供研究使用。非人类或药物使用
试剂盒内容物
每个试剂盒包含两个标记反应组。每个标记反应组由一个小瓶以下各项组成：
组分 | 数量 |
2-AA染料（2-氨基苯甲酸） | 7.5 mg |
2PB还原剂（2-甲基吡啶硼烷） | 16.5 mg |
含30%乙酸的DMSO | 500 µl |
所需的其他试剂和设备
Milli Q水或类似产品
温箱、烤箱或类似的干式加热器（不能使用水浴）设置为65°C
离心式蒸发器（如Savant、Heto或类似产品）
反应瓶（例如聚丙烯微离心瓶）
注意：如果进行可选的标记后样品净化，则需要更多试剂
标记时间线
标记过程需要2小时，而实际标记培养仅需1小时。
步骤 | 时间 | 已用时间（小时） |
将样品转移至反应管并干燥 | 30 min | 0.5 |
向样品中加水 | 15 min | 0.75 |
配制并添加标记试剂 | 15 min | 1 |
用试剂培养样品 | 1 hour | 2 |
标记方法
1，纯化聚糖
如有必要，去除样品中的非碳水化合物污染物
2，将样品转移至反应瓶
该试剂盒的目的是标记高达25毫摩尔的聚糖每反应。用一个单一的纯聚糖，每个反应只有5皮摩尔，可以标记，并在随后的HPLC分析中检测。适合的反应瓶包括小型聚丙烯微型离心管和用于PCR工作的管。
3，干燥样品并重新悬浮在10µL水中
如果样品体积超过10µL，则将样品烘干。
如果样品需要干燥，则应使用离心式蒸发器。如果不能实现，可以谨慎使用冷冻干燥（冻干）。（尤其要确保样品在瓶底干燥成小而致密的质量）。不要将样品置于高温（>28°C）或极端pH条件下，因为这些条件会导致酸催化的唾液酸损失（高温、低pH）或聚糖还原末端差向异构化（高pH值）。将样品干燥，然后将多糖类化合物重新溶解在10微升水中。
4，准备标记试剂
将150微升的试剂盒加入到一小瓶染料中，用移液管混合直至染料溶解。有时需要加热（30-60°C）来帮助溶解染料。
将150µL溶解的染料溶液转移到一小瓶还原剂中，通过移液管混合，直到还原剂溶解。有时需要加热（30-60°C）来帮助溶解还原剂。
5，向样品中添加标记试剂
向每个聚糖样品中加入10µl标记试剂，盖住微管，充分混合，然后轻轻敲击，确保标记溶液位于小瓶底部。
6，孵育
将反应小瓶置于65°C的温箱、砂盘或干燥烘箱中，并孵育1小时。样品必须完全溶解在标签溶液中，才能进行有效的标签。在65°C孵育开始后30分钟，样品可以完全溶解，然后孵育继续进行。
7，离心机和冷却
孵育期结束后，取出样品，短暂离心微管，然后让它们完全冷却至室温。
2-AA-标记聚糖的分析
2-AA标记的聚糖可以通过多种不同的分析方法进行研究，包括HPLC、凝胶电泳和质谱法。
HPLC分析
标记的聚糖混合物可以通过各种HPLC（高压液相色谱法）进行分离和分析
酶分析法
许多公司都提供高纯度的测序级酶，如外糖苷酶，适用于N-和O-连接的标记聚糖。在选择糖苷酶时要特别注意，选择与特定应用相匹配的方法。例如，某些酶和酶缓冲液含有某些类型测定的干扰。
质谱和电泳
标记的聚糖也可以通过质谱、电泳和各种方法进行分析光谱类型。
还原胺化反应
标记反应包括两步过程（见图1）：
1，.希夫碱的形成。
这需要具有自由还原末端的聚糖，该末端在闭环（环状）和开环（非环状）形式之间平衡。染料的伯氨基对无环还原末端残基的羰基碳进行亲核攻击，形成部分稳定的希夫碱。
2，希夫碱的减少。
希夫碱亚胺基团被化学还原，得到稳定的标记聚糖。
图1：通过还原胺化用2-氨基苯甲酰胺酸（2-AA）标记聚糖。
